大腸桿菌檢測試劑盒（熒光PCR法）
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清華科技園廣州創(chuàng)新基地首期啟動區(qū)擁有8萬㎡園林綠化，2萬㎡高規(guī)格研發(fā)辦公樓和6000㎡商務(wù)生活配套。一批高新企業(yè)、清華大學(xué)院系、科研及教育等機(jī)構(gòu)已經(jīng)進(jìn)駐。廣州健侖生物公司作為科技園企業(yè)之一，其實力毋庸置疑！大腸桿菌檢測試劑盒（熒光PCR法），廣州健侖生物公司提供產(chǎn)品及服務(wù)！
- 產(chǎn)品描述
大腸桿菌檢測試劑盒（熒光PCR法）
說 明 書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：大腸桿菌檢測試劑盒（熒光PCR法）
【貨號】
BD-Ⅰ-210
【包裝規(guī)格】
50Tests/kit
【預(yù)期用途】
本品主要用于大腸桿菌檢測鑒定及突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處置，還可用于大腸桿菌的環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生檢疫及感染的輔助診斷。僅供研究、不用于臨床診斷！
【檢測原理】
本試劑盒采用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)及TaqMan熒光探針技術(shù)，對大腸桿菌特異性核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增并檢測，從而判斷大腸桿菌的存在。
【試劑盒組成】
序號 | 組分 | 數(shù)量 | 規(guī)格 |
1 | qPCR Master Mix | 1 | 625μl/管 |
2 | 大腸桿菌反應(yīng)液 | 1 | 375μl/管 |
3 | 大腸桿菌陽性對照 | 1 | 50μl/管 |
4 | RNase Free H2O(陰性對照) | 1 | 100μl/管 |
【儲存條件及有效期】
-20℃避光貯存，避免反復(fù)凍融。有效期12個月（請于有效期內(nèi)使用）。
【適用儀器】
ABI PRISM®7900、ABI PRISM®7500、ABI PRISM®7300、ABI PRISM®7700、ABI PRISM®7000、MJ Opticon 、BIORAD iCycler 、Roch LightCyclerTM、Qiagen Rotor Gene等。
【樣本要求】
樣本采集后應(yīng)及時檢測，否則應(yīng)-20℃保存，避免反復(fù)凍融，使用干冰或液氮運輸。
【檢驗方法】
1.試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
反應(yīng)液組份 | 加量 (μl) |
qPCR Master Mix | 12.5 |
大腸桿菌反應(yīng)液 | 7.5 |
待測標(biāo)本DNA | 5 |
總體積 | 25 |
2.樣本處理（樣本處理區(qū)）
2.1取200μl的待檢樣本及陰性對照樣本進(jìn)行核酸提取。DNA可采用Trizol法、硅膠膜吸附法、磁珠法等微量DNA提取試劑盒提取，按相應(yīng)說明書要求進(jìn)行操作。提取好的DNA應(yīng)及時用于檢測，否則應(yīng) - 20℃保存。
2.2加樣：在準(zhǔn)備好試劑的PCR反應(yīng)管中分別加入陰、陽性質(zhì)控品、待測樣本DNA各5μl，蓋緊管蓋后，瞬時低速離心。
3.PCR擴(kuò)增檢測（擴(kuò)增區(qū)）
待檢PCR管轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，設(shè)定循環(huán)參數(shù)（請參照各類儀器的操作說明進(jìn)行設(shè)置）。
步驟 | 溫度（℃） | 時間 | 循環(huán)數(shù)（次） | |
1 | 預(yù)變性 | 95 | 5分鐘 | 1 |
2 | 變性 | 95 | 10秒 | 40 |
退火、延伸及檢測熒光 | 58 | 45秒 | ||
步驟2中58℃時熒光檢測，檢測通道：FAM | ||||
*注：ABI系列熒光PCR儀不選ROX校正，淬滅基團(tuán)選擇None。
4.結(jié)果分析
ABI7500熒光PCR儀:將 baseline設(shè)為3-15(根據(jù)實際情況，baseline cycler可在一定范圍內(nèi)變化),熒光閾值（threshold）設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的zui高點，且Ct值=40（或顯示為undet）。使用儀器配套軟件自動分析結(jié)果。
5.質(zhì)量控制
試劑盒中提供陽性質(zhì)控品、陰性對照各一個，對應(yīng)Ct值分別為Ct陽、Ct陰；如試劑質(zhì)量完好并操作正確，Ct陽< Ct陰，Ct陽<30，并呈現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，否則實驗無效，應(yīng)檢查儀器、試劑、擴(kuò)增條件等方面的誤差。在每次檢測中應(yīng)設(shè)置陰陽性對照品。
6．實驗結(jié)果的判定
在實驗有效的前提下
Ct值≥38 （或undet） | 陰性結(jié)果 |
|
35≤Ct值<38 | 檢測灰區(qū)，應(yīng)重復(fù)測定兩次 | 重復(fù)測定兩次，Ct值≥38，陰性結(jié)果；其中1次Ct值<38 ，陽性結(jié)果,FAM通道陽性判斷為感染大腸桿菌 |
Ct值<35 | 陽性結(jié)果,FAM通道陽性判斷為感染大腸桿菌 | |
【實驗結(jié)果的解釋】
- 在所有對照都滿足要求的前提下，在35個循環(huán)之前，所有的臨床樣本的反應(yīng)擴(kuò)增曲線都應(yīng)該超過閾值線，這表明擴(kuò)增到足夠量的DNA，也表明了樣本質(zhì)量合格。然而，可能有些樣本會由于初始臨床樣本中的病毒數(shù)量較少而無法出現(xiàn)陽性結(jié)果。
- 在38個循環(huán)之內(nèi)，陰性質(zhì)控品和試劑空白（NTC）熒光增長曲線不應(yīng)該超過閾值線。如果任何其中任何一個的增長曲線超過了閾值線，（1）可能DNA提取試劑污染，在實驗前應(yīng)確保DNA提取試劑無誤。（2）DNA提取過程或建立反應(yīng)加樣過程發(fā)生交叉污染。應(yīng)嚴(yán)格遵照操作程序的要求進(jìn)行重復(fù)實驗。
- 在30個循環(huán)之前，陽性質(zhì)控品應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果。如果沒產(chǎn)生預(yù)期的陽性結(jié)果則視為無效，應(yīng)嚴(yán)格遵照操作程序進(jìn)行重復(fù)實驗。
【參考值范圍】
1.Ct值≥38（或顯示為undet），陰性結(jié)果
2.Ct值<35，陽性結(jié)果
【檢測方法的局限性】
1.樣本在收集、處理、運輸以及保存不當(dāng)時，可能出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。
2.如果反應(yīng)中存在抑制物和過量的DNA模板時也可能出現(xiàn)假陰性。
3.實驗操作的任何失誤都有可能導(dǎo)致無意義的檢測結(jié)果。
【產(chǎn)品的性能指標(biāo)】
本試劑盒能檢測出相當(dāng)于103copies/ml的大腸桿菌 DNA；與非大腸桿菌無交叉反應(yīng)。
【試劑盒使用注意事項】
本試劑盒為體外檢測試劑。操作人員應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)并具有一定經(jīng)驗。
為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性請使用已校準(zhǔn)的移液器，選用進(jìn)口一次性使用的PCR反應(yīng)管、離心管、tip頭等進(jìn)行樣本處理及配液等操作，所有用具應(yīng)不含DNA酶和RNA酶。
實驗應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作；各區(qū)物品,工作服均為,不得交叉使用。實驗后應(yīng)及時清潔工作臺以防污染。
本產(chǎn)品使用前應(yīng)在室溫充分融化，混勻并瞬時低速離心。
標(biāo)本處理應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，以保護(hù)操作人員安全和防止對環(huán)境的污染。
每次實驗應(yīng)設(shè)置陰陽性對照品。不同批號的試劑請勿混用，在有效期內(nèi)使用試劑盒。
實驗樣品盡可能新鮮，提取過程應(yīng)嚴(yán)防DNA酶污染及操作不當(dāng)導(dǎo)致的DNA降解。
在-20℃保存的DNA樣本，加樣前應(yīng)在室溫充分融化、混勻并瞬時低速離心后使用。
分裝有反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)扣蓋或裝入密實袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
加樣時應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。
反應(yīng)液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免物質(zhì)泄露污染儀器。
擴(kuò)增完畢取出反應(yīng)管，密封在塑料袋內(nèi)，丟棄于地點。
實驗中用過的吸頭請直接打入盛有10%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
工作臺及各種實驗用物品經(jīng)常用10%次氯酸鈉、75%酒精和紫外燈進(jìn)行消毒。
實時熒光PCR儀器使用前預(yù)熱30分鐘，連續(xù)進(jìn)行實驗時，儀器間隔一小時以上再使用。
實時熒光PCR儀需經(jīng)常校正和清潔載樣板板孔。
本試劑盒涉及的檢測樣本應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理條例》相關(guān)要求。
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